聚丙烯酰胺凝膠的電泳

聚丙烯酰胺凝膠的電泳

　　聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)，用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸，以下從原理、類型、操作流程、特點(diǎn)、應(yīng)用等方面展開介紹：

　　原理

　　聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。在電場作用下，帶電粒子（如蛋白質(zhì)或核酸）會(huì)向與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。聚丙烯酰胺凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成許多微小孔隙，這些孔隙的大小可以通過改變聚丙烯酰胺的濃度來調(diào)整。不同大小的分子在通過凝膠孔隙時(shí)受到的阻力不同，較小的分子可以快速通過凝膠層，而較大的分子會(huì)受到更大的阻力而移動(dòng)較慢，從而實(shí)現(xiàn)分離。

　　類型

　　非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）：在電泳過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。在DNA的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，DNA呈雙鏈狀態(tài)泳動(dòng)，其遷移率會(huì)受堿基組成和序列的影響。

　　變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：由于加入了變性劑（蛋白質(zhì)變性劑常為SDS，核酸變性劑常為尿素、甲酰胺等），分離僅依據(jù)于分子量大小。以SDS-PAGE為例，SDS是陰離子去表面活性劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑如巰基乙醇、二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白-SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異，使蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于它的相對(duì)分子質(zhì)量，而與所帶電荷和分子形狀無關(guān)。

　　操作流程

　　凝膠制備：灌制聚丙烯酰胺凝膠常在兩塊封閉的玻璃平板所形成的夾層間進(jìn)行，以減少氧對(duì)聚合的抑制作用。根據(jù)玻璃板的大小和間隔片的厚度計(jì)算所需凝膠的體積，將丙烯酰胺、亞甲雙丙烯酰溶液等按比例混合，加入引發(fā)劑和催化劑后迅速注入玻璃板之間，插入梳子，等待凝膠聚合。

　　上樣：當(dāng)準(zhǔn)備好進(jìn)行電泳時(shí)，小心取出梳子，用緩沖液沖洗加樣孔。將待測樣品與適量上樣緩沖液混合，用微量移液管加入加樣孔，同時(shí)加入分子量標(biāo)志作為對(duì)照。

　　電泳：將凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，連接電極與電源，打開電源進(jìn)行電泳。電泳時(shí)間和電壓可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)參照染料遷移至所需位置時(shí)，關(guān)閉電源。

　　染色和觀察：電泳結(jié)束后，卸下玻璃板，將凝膠進(jìn)行染色。聚丙烯酰胺凝膠中核酸帶的染色常用溴化乙錠法和銀染法，銀染法的靈敏度較高。染色后，在紫外光下分析、拍照，觀察樣品中不同分子的分離情況。

　　特點(diǎn)

　　高分辨率：凝膠孔徑可調(diào)，通過改變丙烯酰胺和交聯(lián)劑比例，可精準(zhǔn)分離不同分子量的生物大分子。

　　可調(diào)孔徑：可根據(jù)待測物質(zhì)的大小調(diào)整凝膠的孔隙大小，實(shí)現(xiàn)選擇性分離。

　　化學(xué)穩(wěn)定性好：凝膠耐高溫和酸堿，不易變形，允許施加高電壓以縮短電泳時(shí)間。

　　透明度高：便于染色和成像。

　　應(yīng)用

　　蛋白質(zhì)分析：可用于測定蛋白質(zhì)分子量、分析蛋白質(zhì)純度、研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能等。例如，在蛋白質(zhì)表達(dá)的研究中，通過SDS-PAGE可以檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況；在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，二維電泳的第一維常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳。

　　核酸分析：用于分析和制備長度小于1kb的DNA片段，如基因突變的檢測、DNA測序等。

　　臨床診斷：可用于檢測血液、尿液等生物樣本中的特定蛋白質(zhì)或核酸，輔助疾病的診斷和病情監(jiān)測。

　　與其他技術(shù)結(jié)合：可與Western blotting技術(shù)相結(jié)合，用于檢測特定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。